Awgrymiadau sylfaenol ar gyfer cryopreservation diwylliannau celloedd

Awgrymiadau sylfaenol ar gyfer cryopreservation diwylliannau celloedd

Mae celloedd yn parhau â'u metaboledd yn ystod gweithgareddau twf arferol, sy'n gofyn am gyfranogiad amrywiol broteinau. Pan fydd y tymheredd yn gostwng o dan -70 ° C, mae proteasau'n stopio gweithio. Felly, mewn amgylchedd sydd â thymheredd isel iawn, gall celloedd atal eu gweithgareddau metabolaidd a mynd i mewn i gyflwr segur sy'n caniatáu storio yn y tymor hir.

1. Deunyddiau Arbrofol

Deunydd sylfaen:

Cyfrwng diwylliant sylfaenol

Serwm (FBS/NBS confensiynol)

Mainc Gwaith UltraPure

Sylffocsid dimethyl di -haint (DMSO)

Datrysiad halen byffer ffosffad PBS di -haint

Gwn pibetio

Gwn pibetio trydan

Paratoi'r arbrofion

a) Paratoi'r datrysiad rhewi:

Celloedd Cyffredinol: 55% cyfrwng gwaelodol + 40% serwm buchol (fbs/nbs) + 5% dmso

Celloedd hanfodol: serwm buchol 90% (FBS/nbs) + 10% DMSO

Aliquot y toddiant cryopreservation parod mewn tiwb centrifuge 15 ml [nyth] a'i storio ar 4 ° C i'w ddefnyddio'n ddiweddarach.

(b) Paratoi celloedd i'w rhewi:

Cyn rhewi'r celloedd, dewiswch gelloedd â statws twf da ac yn y cyfnod twf logarithmig a rhoi canolig ffres 12-24 awr yn eu lle cyn rhewi i gynnal cyflwr celloedd.

2. Gweithdrefn Arbrofol

1. Arsylwch ddwysedd y celloedd sydd i'w rhewi, sydd tua 80%~ 90%. Defnyddiwch gwn pibed i allsugno'r hen gyfrwng, ychwanegwch PBS di-haint i olchi'r celloedd 1-2 gwaith, a thynnwch y cyfrwng sy'n weddill yn yr amgylchedd diwylliant.

2. Ychwanegwch swm priodol o trypsin neu sudd treulio i ganiatáu i'r trypsin fynd i mewn i'r celloedd, a'u rhoi yn y deorydd i'w dreulio. Sylwch ar gyflwr y celloedd o dan y microsgop: mae'r cytoplasm yn tynnu'n ôl ac nid yw'r celloedd bellach wedi'u cysylltu â chynfasau. Ar y pwynt hwn, ychwanegwch yr ateb stopio i atal y broses dreulio.

3. Swigenwch y celloedd yn ysgafn gyda blaen i ffurfio ataliad celloedd a centrifuge yr ataliad celloedd ar 1000 rpm am 3-5 munud.

Gwaredwch yr uwchnatur, ychwanegwch swm priodol o doddiant rhewi, a phibed ysgafn i wneud i'r celloedd gyfrif yn unffurf. Addaswch ddwysedd y gell gyda chyfrwng cryopreservation i wneud y dwysedd terfynol 5 × 106/ml ~ 1 × 107/mL.

4. Defnyddiwch gwn pibed i wahanu'r tiwbiau cryogenig yn ôl y gallu disgwyliedig, a defnyddio peiriant capio awtomatig i gapio a selio.

5. Mae'r rhaglen cryopreservation safonol yn gyfradd oeri o -1 ° C i -2 ° C/min, a gellir rhewi'r celloedd sydd i'w rhewi yn raddol yn ôl y camau canlynol: tymheredd yr ystafell → 4 ° C (20 munud) → - 20 ° C (30 munud) → -80 ° C ° C (dros nos) → Storio tymor hir mewn nitrogen hylifol.

Gellir ei storio'n uniongyrchol mewn rhewgell ar -80 ° C dros nos ac yna ei drosglwyddo i nitrogen hylif i'w storio.

Mae Yongyue Medical yn fenter uwch-dechnoleg sy'n arbenigo mewn Ymchwil a Datblygu, cynhyrchu a gwerthu nwyddau traul biofeddygol. Awgrymiadau pibed, pibellau, plât PCR, cynhyrchion diwylliant celloedd a nwyddau traul labordy biolegol eraill. Mae Yongyue Medical yn deilwng o'ch ymddiriedaeth a'ch dewis! Croeso i ymgynghori!